Die Aussaat von Freilandorchideen
- Teil 3 - Materialen für die asymbiotische Aussaat -
Hier geht es schon einmal etwas um das sterile Arbeiten, aber zuvor zeige ich die Werkzeuge. Nicht alles ist unbedingt notwendig, manches wird man vielleicht auch erst später anschaffen, wenn man weiß, dass dieses Hobby wirklich Spaß machen wird.
Es muss auch jeder seine eigene Arbeitstechnik entwickeln. So wie ich hier meine Technik zeige, ist sie im Laufe der letzten fünf Jahre entstanden, und das heißt nicht, dass man es nur so machen kann. Aber ich habe damit für mich zufriedenstellende Ergebnisse erzielt und weiß, dass es so geht. Alternativen sollte man ausprobieren, wenn man mehr Erfahrung gesammelt hat.
Ich säe heute meistens in Reagenzgläser aus. Sie haben den Vorteil, dass je Glas nur wenig Nährboden benötigt wird – nur 5 bis 6 ml - und somit kann man viele Gläser füllen, dabei die Zutaten variieren und auch bei jedem Arbeitsgang in mehrere Gläser aussäen.
Ich verwende die Reagenzgläser der Maße 16 x 160 mm mit Bördelrand:
Es gibt noch Gläser ca. 14 x 130 mm ohne Bördelrand, die habe ich versehentlich einmal im Internet gekauft, nutze die aber nur im Notfall, weil man die Gläser nur durch den Bördelrand sicher verschließen kann. Also die nachstehenden nicht:
Die Aussaat kann natürlich auch in Rundgläser oder Petrischalen erfolgen. Profis verwenden Kunststoff-Petrischalen, bei Massenvermehrungen haben sie Vorteile. Aber es gibt auch Nachteile, z.B. muss der Nährboden in bereits steriler Form eingefüllt werden, und preiswerter sind sie auch nicht.
Als nächstes braucht man eine Waage. Die ist zum einen für größere Mengen, z.B. Wasser, eine normale Küchenwaage, aber für kleine Mengen bis ca. 30 g braucht man eine Feinwaage, wie es sie günstig im Internet zu kaufen gibt. Meine ist ja nicht mehr ganz neu, es gibt jetzt bessere, mít meiner kann man die zweite Stelle hinter dem Komma ablesen, d.h. 10 mg. Das heißt aber nicht, dass man damit 10 mg abwiegen kann, die Genauigkeit reicht dafür nicht aus. Aber zum Abmessen von 6 g Agar oder 15 g Zucker oder 2 g Aktivkohle ist sie genau richtig:
Dazu gibt es ein Eichgewicht von 25 g, mit dem man die Waage von Zeit zu Zeit eichen kann. Man merkt aber gleich, dass die Werte immer etwas hin- und herlaufen.
Die Waage kann prinzipiell 50 g abwiegen, aber man muss darauf achten, dass das Messgefäß leicht ist, sonst bekommt man zu oft Fehlermeldungen. Ich benutze einen PP-Becher aus meiner Zeit als Entwickler von Fotos:
Wenn ich wirklich exakt wägen will, dann benutze ich eine Analysenwaage, die ich mir mal günstig und gebraucht im Internet gekauft habe. Auf dieser Waage messe ich die Stoffe für die Nährböden ab, insbesondere auch die Spurenelemente, Pflanzenhormone und Vitamine für die Stammlösungen. Ich kann damit einigermaßen sicher 1 mg abwiegen, die Anzeige ist dabei 0,1 mg:
Prinzipiell kann man natürlich auch mit einer einfacheren Waage wie zuvor abgebildet, über Stammlösungen auch winzige Mengen messen kann. Das Problem ist dabei nur, dass man dann die hundertfache Menge zunächst einmal einsetzen muss, und wenn die Substanz labil ist, schmeißt man eben 99% weg. Die Pflanzenhormone sind relativ teuer. Na gut, es geht aber.
Flüssigkeiten messe ich entweder bei größeren Mengen mit einem Messzylinder, sehr gern aber auch mit medizinischen Spritzen, wie man sie preiswert in der Apotheke bekommt. Ich habe da Insulinspritzen mit 1 ml, unterteilt in 40 Skalenteile, d.h. 5 Skalenteile - und weiter sollte man nicht gehen - entsprechen 0,125 ml. Diese Spritze empfiehlt sich insbesondere bei der Dosierung von Hormonen, bei denen ja nur 0,2 bzw. 0,5 mg pro Liter Nährboden zugegeben werden.
Dann habe ich noch Spritzen mit 2 ml, mit 5 ml und die oft gebrauchten grünen mit 10ml. Die mit 10 ml setze ich insbesondere beim Absaugen von Kondenswasser oder Resten an Bleichflüssigkeit aus den Gläsern ein. Außerdem dosiere ich damit den gerade gekochten flüssigen Nährboden in die Reagenzgläser. Eine Spritze von 50 ml benutze ich zur Dosierung von noch flüssigem Nährböden in Rundgläser zum Umlegen.
Wichtig sind auch die richtigen Kanülen. Ich benutze Kanülen mit den Maßen 0,9 x 40 mm (gelb). Falls aber die Samen während der Desinfektion in der Lösung dispergieren, d.h. sich weder oben noch unten absetzen, kann man sie nicht ohne weiteres von der Lösung abtrennen. Dafür kann man dann Kanülen von 0,4 x 20 mm (rot) oder 0,6 x 30 mm (blau) verwenden, das muss man ausprobieren.
Flüssigkeiten kann man auch gut mit einer Messpipette dosieren. Wenn die Flüssigkeiten Chemikalien sind, sollte man nicht mit dem Mund ansaugen sondern einen sog. Peleusball verwenden. Ich habe ihn noch aus dem Studium. Man kann daran sehen, dass Gummi auch nach Jahrzehnten nicht spröde werden muss, wenn die Qualität gut ist:
Als nächstes zeige ich die Folterinstrumente - im Gegensatz zum Mittelalter ist alles aus Edelstahl:
Ganz links die etwas grobe Pinzette verwende ich zum Herausziehen der Wattestopfen aus den Reagenzgläsern. Die nächsten beiden Pinzetten sind zum Hantieren mit Protokormen und Sämlingen gedacht. Die rechte ist eine Pinzette aus dem Elektroniklabor, ziemlich teuer und schon mehr als 30 Jahre alt. Die linke habe ich kürzlich im Dutzend zu je 1,50 EUR gekauft, sie ist etwas klobig, erfüllt aber alle Anforderungen. Wichtig ist, dass die Enden flach sind und nicht spitz. Die Protokorme sollen doch nicht erstochen werden!
Dann kommen zwei Mikrospatel. Der linke wird mit dem rechteckigen Ende zur Aussaat verwendet, d.h. die Samen werden damit aus dem Bleichröhrchen heraus gekratzt und in die Gläser transportiert und dort in den Nährboden etwas eingedrückt. Der rechte dient mit der kleinen Schaufel zum Dosieren von Symbiosepilz-Agar, um damit weitere Gläser zu infizieren – das kommt später. Man kann damit aber auch sehr gut Samen in den Rundgläsern verteilen. Zur Not kann man mit dem rechteckigen Ende des Löffelspatels auch die Samen aus den Desinfektionsröhrchen holen, aber dieses Ende ist im Vergleich zum anderen Spatel ziemlich dick, was das Herauskratzen der Samen etwas schwierig gestaltet. Aber wenn einem der sterile andere einmal herunter fällt, dann ist man froh, wenn man noch einen sterilen Löffelspatel hat.
Dann kommt ein Skalpell, wobei Klinge und Halter hier getrennt sind. Ein Skalpell benötigt man zur Grünaussaat, bei der nur die noch grüne Samenkapsel von außen desinfiziert und dann zerschnitten wird. Ein scharfes Messer ohne Halter ginge auch, aber Skalpelle sind sehr scharf und gar nicht teuer.
Ja, ganz rechts kommt dann ein Spatel, von dem ich nicht mehr weiß, woher ich den habe. Er ist ideal geeignet, den mit Sämlingen besetzten Nährbodenpfropfen aus den Reagenzgläsern herauszuziehen, damit man die Protokorme oder Sämlinge in andere Gläser umlegen kann. Notfalls kann man eine dickere Stricknadel an einem Ende mit einem Hammer platt klopfen und etwas umlegen.
Da die Werkzeuge steril sein müssen, habe ich nach einigem Nachdenken ein primitives Verfahren entwickelt, bei dem man aber sehr gut erkennen kann, was man vor sich hat. Früher hatte ich alle Geräte in Alufolie eingewickelt sterilisiert, aber dann wusste ich oft nicht, was darin eingepackt war. Heute stecke ich die Geräte einzeln in Reagenzgläser, verschließe sie mit einem Stück Alufolie und sterilisiere sie:
Frischhaltefolie und Alufolie, da gibt es unterschiedliche Qualitäten und Preise. Hier gilt wieder einmal nicht: Gut und teuer, nein die billigen sind besser. Ich hole mir die Folien bei Rossmann:
Diese Glaselektrode muss in einer Lösung von ca. 20 g Kaliumchlorid in 100 ml Wasser gelagert werden, dann hält sie viele Jahre lang:
Sie stammen ursprünglich von Fa. Neolab, allerdings habe ich diese Röhrchen dort nicht mehr im Sortiment gefunden. Wichtig ist, dass der Übergang in der Öffnung glatt ist, damit man die Samen gut herauskratzen kann. Ich sterilisiere diese Röhrchen auch, nicht so sehr damit sie selbst steril sind, sondern eher, um zu verhindern, dass einzelne Samen von der vorherigen Benutzung hängen bleiben und mir z.B. bei Amerorchis Keimung vorgaukeln, und in Wirklichkeit ist es nur eine Dactylorhiza maculata. Man nennt so etwas - glaube ich - "Sterilisationsmutanten".
Diese Desinfektion der Samen nennt man „bleichen“, weil die Testa der Samen und die Embryohülle im Laufe von 5 - 60 Minuten in der Farbe heller werden.
Zum Bleichen benutze ich normalerweise eine 0,5%ige Lösung von DanKlorix. Wichtig ist, dass es die blaue Flasche ist.
Es gibt noch eine grüne Flasche, die enthält aber noch Tenside und ist für unsere Zwecke nicht geeignet. Der Wirkstoff ist Natriumhypochlorit - NaOCl, der Gehalt beträgt 2,8%, d.h. 2,8 g NaOCl pro 100 ml.
Wenn man eine Bleichlösung ansetzen will, muss man ja von 2,8% auf 0,5% verdünnen. Hier ist ein Beispiel, das man dann beliebig nach dem Dreisatz umrechnen kann:
9 ml DanKlorix und 41 ml dest. Wasser = 50 ml 0,5%ige Bleichlösung.
Hier ist noch eine Anzahl von Umlegegläsern in verschiedenen Größen:
Da wir noch bei den Geräten sind, hier ist ein idealer Drucktopf zum Sterilisieren:
Es ist ein Sicomatic von rechnerisch 6,8 Liter Volumen, der zwar neu recht teuer ist, den man aber häufig auf Auktionen günstig kaufen kann. Der beim Sterilisieren durch den Dampfdruck heraustretende Stift hat zwei Markierungsringe. Richtig ist das Sterilisieren, wenn der zweite Ring sichtbar ist, dann herrschen im Topf Temperaturen von etwa 118°C.
Man füllt etwa 3 bis 4 cm Wasser ein und stellt die zu sterilisierenden Geräte auf den Einsatz, so dass diese nicht im Wasser stehen. Der Topf wird mit dem Deckel verschlossen, aber man lässt das Ventil, das man am Griff kontrollieren kann, noch offen. Man erhitzt zunächst bei geöffnetem Ventil so lange, bis ca. eine Minute lang nasser Dampf austritt - man fühlt das mit der vorgehaltenen Hand. Zunächst muss nämlich die Luft aus dem Topf entfernt werden, sonst kommt man nicht auf die notwendige Temperatur. Wenn sich der Dampfstrom dann richtig nass anfühlt wird das Ventil geschlossen, der Herd herunter geregelt, so dass der zweite Ring sichtbar wird. Dann überlässt man das Ganze 30 min sich selbst. Danach wird der Topf vom Herd genommen und auskühlen gelassen, erst dann geöffnet. Auf keinen Fall den Dampf ablassen; wenn z.B. Nährboden sterilisiert wurde würde dieser im Topf aufkochen und überschäumen. Erst wenn der Stift wieder eingezogen ist kann man den Topf öffnen.
Ich würde empfehlen als Wasser für den Topf dieses übliche sog. destillierte = demineralisierte zu nehmen; denn bei ständiger Verwendung von Leitungswasser im Topf wird der Mechanismus in Griff und Ventil allmählich verkalken. Ich vermute, dass dies durch Spritzer verursacht wird; denn wenn das Wasser immer nur nachgefüllt wird, konzentriert es sich ja allmählich an Calcium und Magnesium auf.
In dem abgebildeten Topf kann man z.B. ca. 50 Reagenzgläser mit Nährboden gleichzeitig sterilisieren, indem man jeweils 12 - 13 Gläser in Honiggläser einstellt. Diese Technik wird im nächsten Teil beschrieben.
Ein Wort zum Backofen, der ja oft als Alternative zum Sicomatic erwähnt wird. Ich habe das nie gemacht, weil ich schon zu Beginn einen Drucktopf hatte. Es ist wohl möglich, die Gefahr des Überschäumens der Nährböden ist bei zu heißer Einstellung zu beachten, wie gesagt, Erfahrungen habe ich damit nicht. Allerdings bekommt man im Nährboden nie die zur richtigen Sterilisierung notwendigen 118°C, man erreicht drucklos lediglich 100°C, egal wie heiß man den Herd einstellt.
Ehe ich beim nächsten Teil auf die Zubereitung des ersten Nährbodens eingehe, hier noch die Abbildung einer Sterilbank:
Diese Sterilbank ist weitgehend nach der Anleitung von Thomas Ederer von mir gebaut worden, Kosten ca. 300 EUR.
Oben filtert eine Matte die Luft vor, im oberen Teil sitzt auch das Gebläse, das die Luft durch das senkrecht stehende Hepafilter drückt. Der vordere Reinraum hat etwa die Maße (Breite, Tiefe, Höhe) von 70 x 50 x 40 cm. Sichtbar ist eine Plexiglasscheibe, die in zwei Rasten verstellbar ist. Die untere Einstellung ist für das empfindlichere asymbiotische Arbeiten, die obere für das Arbeiten mit Symbiosepilzen. Die Scheibe verhindert das Bilden einer Luftwalze, durch die unreine Falschluft eingezogen werden könnte.
Die melaminbeschichteten Platten sind 16 mm stark, Thomas Ederer hatte 19 mm empfohlen. Allerdings hat die Bank schon bei 16 mm-Platten über 40 kg Gewicht. Ich habe das Konzept noch etwas abgewandelt, klemme das Hepafilter nicht an sondern klebe es mit Silikon ein und habe eine senkrecht durchgehende Platte, die nur die Öffnung für das dann eingeklebte Filter hat. Damit stelle ich absolut sicher, dass keine unreine Falschluft von der Druckseite in den Reinraum gerät.
Noch kurz ein Wort zum sterilen Arbeiten. Das Innere des Reinraums ist ja zunächst nicht steril. Ich habe zu Beginn die Bank mit Brennspiritus zur Desinfektion ausgewischt. Das ist absolut nicht sicher. Dann habe ich Mikrozid AF zum Auswischen verwendet. Das war schon besser. Da ich auf den Geruch der Alkoholmischung aber allergisch reagiere und 1-Propanol relativ giftig ist, habe ich schließlich etwas ganz Anderes ausprobiert, heute wische ich die Bank vor Gebrauch mit 0,5%igem Natriumhypochlorit aus, d.h. mit auf 0,5% eingestelltem DanKlorix, dem ich ein paar Tropfen Spülmittel zusetze. Am besten, man lässt dann in dem Zimmer eine Zeitlang das Fenster offen und tut in dieser Zeit etwas anderes. Der Geruch ist anfangs etwas störend, aber er verfliegt auch schnell. Das Hepafilter darf aber mit der Lösung nicht in Kontakt kommen, und Latexhandschuhe braucht man in jedem Fall, da die Lösung ätzend ist.
© Text und Bilder: Dr. Claus Rüdiger Bernert - @